Chironomidae Meta-barcoding

• PI: 郭美華老師
• 簡單的 Material and Methods 會寫在 03.MM 中

分析流程 1 - ZOUT table

• 此處的分析目的為生成 Sample-ZOTU 的 matrix 與圖片，結果儲存在 01.ZOTU_Results 中

Script	處理過程	狀態
preprocess.sh	- 對 32 個樣站的 raw fastq（fastq）進行前處理，包含用 cutadapt 移除 primers，與用 usearch 做 merge, reverse complement 與 filter （01.ZOTU_Results/fastq_trimmed、01.ZOTU_Results/fastq_merged）	Done
otu.sh	- 用 usearch 做 denoise 並生成 otu 與格式整理，結果為 zotus.fa、unoise3_result.txt、zotutab97.txt、zmap97.txt 與 zmap97_tidy.txt	Done
visualization.Rmd	- 用 R 做格式整理與用 R package GUniFrac 生成圖片 "rarecurve.pdf" ，與 zotu matrix "sample_zotu_matrix_raw.csv" 。 - 生成標準化後的 "sample_zotu_matrix_norm.csv"，判定可以移除樣站 "A3" "A9" "D6" "S3" "S6" "S9"？	Done
visualization.Rmd	- plots: Alpha Diversity, PCoA, Heatmap, and clustering relative abundance (barplot+dendrogram)	Done

分析流程 2 - Assign Taxonomy to ZOTU

• 此處的分析目的為訓練 RDP classifier 並分類所有 ZOTU，結果儲存在 02.Classifier_Results 中
• ncbi search term: (((((("Arthropoda"[Organism] OR Arthropoda[All Fields]) OR ("Annelida"[Organism] OR Annelida[All Fields])) OR ("Nematoda"[Organism] OR Nematoda[All Fields])) OR ("Platyhelminthes"[Organism] OR Platyhelminthes[All Fields])) OR ("Myxozoa"[Organism] OR Myxozoa[All Fields])) NOT sp.[All Fields]) AND COI[All Fields] AND ("640"[SLEN] : "660"[SLEN])
• ncbi 下載為 ref/sequence.gb 與 ref/sequence.fasta，因為檔案過大所以會另外給
• rdp_classifier_2.14 分類器也因為太大而不會上傳上來，只保留根據我們資料訓練好的 02.Classifier_Results/rdp_training

Script	處理過程	狀態
tidy_ref.Rmd	- 整理 ncbi 下載 ~640000 個序列的 ref/sequence.gb，儲存為 ref/taxonomy_tidy.txt 與 taxonomy_tidy_IDs.txt，內有分類資訊	Done
train.sh	- 根據整理好的 ref/taxonomy_tidy.txt 篩選 ref/sequence.fasta，只留下有完整分類資訊的序列 （ref/tidy_extract.fasta）	Done
train.sh	- 用工具去整理 ref/taxonomy_tidy.txt 與 ref/tidy_extract.fasta 格式，使其可以被訓練成 rdp classifier	Done
train.sh	- train rdp classifier，生成 rdp_training 資料夾	Done
classify.sh	- 利用訓練好的 rdp classifier 去對 zotu.fa 進行分類，結果為 zotu_taxonomy.txt	Done
visualization.Rmd	- filter out confidence 不高的分類結果，進行視覺化	Running

其他

Script	Description	Status
	- 寫簡單的 mateirals and methods 在 03.MM	Pending